近几年，血液學(xué)、细胞遗传學(xué)和分(fēn)子學(xué)监测已成為(wèi)慢性髓性白血病（CML）治疗的重要组成部分(fēn)。中华医學(xué)会血液學(xué)分(fēn)会、中國(guó) CML 联盟组织专家根据國(guó)外指南或推荐，结合國(guó)内研究经验，起草(cǎo)制定了中國(guó) CML 诊疗监测规范，以期為(wèi)國(guó)内血液科(kē)医师提供有(yǒu)关 CML 诊疗的重要参考。

1. CML 疗效监测的临床意义

CML 是首个被识别的发病与特定染色體(tǐ)或基因相关的肿瘤性疾病，其标志(zhì)性特征為(wèi) Ph 染色體(tǐ)，即 t（9；22）（q34；q1l），致病基础為(wèi)位于 9q34 上的 c-ABL 易位至 22ql1 上 BCR 基因 3 端，形成 BCR-ABL 融合基因。

CML 治疗从化疗时代的追求缓解症状或血液學(xué)反应，到干扰素时代的追求细胞遗传學(xué)反应，转变為(wèi)造血干细胞移植（HSCT）和酪氨酸激酶抑制剂（TKI）时代的追求分(fēn)子學(xué)反应，體(tǐ)现了 CML 诊疗和监测理(lǐ)念的变更。

干扰素使得少数 Ph 染色體(tǐ)减少或消失的患者生存期显著延長(cháng)，显示了细胞遗传學(xué)监测的意义。HSCT 后 BCR-ABL 基因转录本持续阳性或髙水平表达、由阴性变為(wèi)阳性或表达水平逐渐升髙预示疾病复发，體(tǐ)现了分(fēn)子學(xué)监测的重要性。

在接受 TKI 治疗后，80%~90% 新(xīn)诊断 CML 慢性期（CP）患者获得了完全细胞遗传學(xué)反应（CCyR），髙度敏感的实时定量 PCR（RQ-PCR）技术成為(wèi)评估 CCyR 患者體(tǐ)内白血病负荷的唯一手段。

大量研究证实，TKI 治疗早期（3、6 和 12 个月）的细胞遗传學(xué)或分(fēn)子學(xué)反应程度与患者遠(yuǎn)期的无疾病进展生存（PFS）和总生存（OS）有(yǒu)显著相关性：治疗 3 个月时能(néng)否达到國(guó)际标准化 BCR-ABL（BCR-ABLIS）<10% 被证实為(wèi)早期识别预后不良患者的独立预后指标，6 个月达到 CCyR 预示最佳疗效，12 个月获得 CCyR 与 OS 期显著延長(cháng)相关，12 或 18 个月获得主要分(fēn)子學(xué)反应（MMR）与長(cháng)期无事件生存显著相关。

治疗中如丧失曾经获得的最佳血液學(xué)、细胞遗传學(xué)或分(fēn)子學(xué)反应、出现新(xīn)的 Ph 阳性染色體(tǐ)克隆演变或 ABL 突变，提示治疗失败或疾病进展。在导致 TKI 冶疗失败或耐药的机制中，BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变最為(wèi)多(duō)见，占耐药患者的 30%~80% ，耐药细胞的突变类型与 TKI 克服耐药的能(néng)力密切相关，因此需要根据 ABL 突变检测结果调整治疗策略。

目前，TKI 冶疗中 3、6、12 个月以及之后任意时间点的血液學(xué)、细胞遗传學(xué)和分(fēn)子學(xué)反应已被列人國(guó)内外 CML 诊疗推荐或指南的 TKI 反应评估标准，不仅用(yòng)于评估疗效，更重要的是為(wèi)了早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。下文(wén)将对血液學(xué)、细胞遗传學(xué)及分(fēn)子學(xué)监测予以分(fēn)别阐述。

2. CML 疗效的监测

2.1 CML 的血液學(xué)监测

CML 的血液學(xué)异常及监测方法：CML-CP 患者就诊时外周血细胞分(fēn)析可(kě)见 WBC 显著升髙，PLT 正常或升髙。人工分(fēn)类可(kě)见各阶段粒细胞，以中、晚幼粒细胞為(wèi)主，嗜碱和嗜酸粒细胞比例多(duō)增髙。

进人加速期（AP）或急变期（BC）后，患者可(kě)出现 WBC 增髙并难以控制，HGB 进行性下降，PLT 增髙或减低，外周血分(fēn)类可(kě)出现原始细胞或者嗜碱粒细胞增髙。血液學(xué)监测对于准确判断病情、评估疗效、识别药物(wù)的血液學(xué)不良反应并及时进行相应处理(lǐ)有(yǒu)重要的意义。

CML 患者的血液學(xué)监测以外周血细胞计数和人工分(fēn)类為(wèi)主，在初次诊断及病情可(kě)能(néng)出现进展时必须进行骨髓细胞學(xué)的分(fēn)析，进展期患者应定期进行骨髓细胞學(xué)检测。

完全血液學(xué)反应（CHR）的定义： CHR 是 CML 患者最基本的治疗目标之一，其定义為(wèi)外周血 WBC<10×109/L，PLT<450×109/L，外周血人工分(fēn)类无不成熟粒细胞，嗜碱粒细胞 <0.05，无 CML 的症状和體(tǐ)征，脾脏不能(néng)触及。接受 TKI 治疗后 3 个月未获得 CHR 為(wèi)治疗失败的指征之一。

血液學(xué)监测的时机： CML 患者确诊后通常每 1~2 周进行 1 次外周血细胞计数和分(fēn)类检测，获得 CHR 后可(kě)每 3 个月监测 1 次。CML 患者接受 TKI 冶疗初期，為(wèi)早期识别 TKI 的血液學(xué)不良反应，可(kě)适当增加血液學(xué)监测的频率。进展期患者或 CML-CP 患者病程中出现可(kě)疑的疾病进展迹象时，应及时进行血液學(xué)监测。

2.2 CML 的细胞遗传學(xué)监测

CML 的细胞遗传學(xué)异常：约 95% 的 CML 患者经常规核型分(fēn)析可(kě)检出 t（9；22）（q34；q11），其余 5% 的患者需经荧光原位杂交（FISH）或 RT-PCR 检测检出 BCR-ABL 融合基因。

约 90% 的 CML-CP 患者為(wèi) 46，t（9；22）假二倍體(tǐ)核型，10% 的患者除 t（9；22）外还有(yǒu) -Y、+8、i（17q）或 +ph 等附加染色體(tǐ)异常。CML-AP 和 CML-BC 患者伴有(yǒu)附加染色體(tǐ)异常的比例达 40%~70%。CML-CP 患者病程中出现染色體(tǐ)克隆演变，也是进人 AP 的诊断依据之一。

细胞遗传學(xué)反应的定义： CML 患者的细胞遗传學(xué)反应应根据患者骨髓细胞中期分(fēn)裂象中 Ph 染色體(tǐ)的比例确定，可(kě)分(fēn)為(wèi)以下 5 个级别：

CCyR：无 Ph 中期分(fēn)裂象；

部分(fēn)细胞遗传學(xué)反应（PCyR）： Ph 染色體(tǐ)中期分(fēn)裂象比例為(wèi) 1%~35%；

次要细胞遗传學(xué)反应（minorCyR）： Ph 染色體(tǐ)中期分(fēn)裂象比例為(wèi) 36%~65%；

微小(xiǎo)细胞遗传學(xué)反应（miniCyR）： Ph 染色體(tǐ)中期分(fēn)裂象比例為(wèi) 66%~95%；

无细胞遗传學(xué)反应（noCyR）： Ph 染色體(tǐ)中期分(fēn)裂象比例 >95%。

CML 细胞遗传學(xué)检测方法： CML 患者细胞遗传學(xué)检测方法包括显带法染色體(tǐ)检测和 FISH。染色體(tǐ)检测的标本来源以骨髓為(wèi)宜，当骨髓穿刺失败时，如外周血 WBC>10×109/L 且原始细胞 + 幼稚细胞比例 >0.100，也可(kě)采用(yòng)外周血细胞作為(wèi)检测标本。

FISH 检测通常以外周血或骨髓制备的染色體(tǐ)悬液為(wèi)标本来源，新(xīn)鲜的骨髓涂片或外周血涂片也作為(wèi) FISH 的标本来源。抗凝剂通常选择肝素钠，肝素锂尤其是 EDTA 可(kě)对细胞的活性产生不利影响。标本从患者體(tǐ)内抽取后应尽快送至实验室进行处理(lǐ)，以当天或 24h 内送达為(wèi)宜，夏季和冬季应采取措施防止运输过程中标本温度过低或过髙。

标本按常规方法计数、接种、培养和收获，并以热变性 R 显带技术或 G 显带技术进行显带。核型分(fēn)析需分(fēn)析≥20 个中期分(fēn)裂象。核型结果需遵循《人类细胞遗传學(xué)國(guó)际命名體(tǐ)制（ISCN）2013》进行描述。

细胞遗传學(xué)监测的时机： CML 患者初诊时应进行骨髓细胞遗传學(xué)分(fēn)析。疑诊 CML 的患者核型分(fēn)析失败或未检出 Ph 染色體(tǐ)时，应用(yòng) BCR-ABL 探针进行 FISH 检测有(yǒu)助于确定 CML 的诊断。在ΤΚI 冶疗开始后 3、6、12 个月应进行细胞遗传學(xué)反应的评估。

获得 CCyR 后，无法通过國(guó)际标准化 RQ-PCR 进行 BCR-ABL 监测的患者应每 12 个月进行骨髓细胞遗传學(xué)监测，采用(yòng) RQ-PCR（以 BCR-ABLIS 表示）监测的患者，若持续保持 MMR 可(kě)忽略骨髓细胞遗传學(xué)检测，而未达 MMR 或丧失 MMR 的患者应每 12~18 个月检测 1 次。根据 ELN2013 年推荐，CML 患者在获得 CCyR 后，可(kě)采用(yòng) FISH 检测外周血间期细胞替代常规骨髓染色體(tǐ)检查，通常需分(fēn)析 >200 个细胞，CCyR 的定义為(wèi) Ph 阳性细胞 <1%。

CML 患者ΤΙΚΓ冶疗失败或出现疾病进展时，应及时进行包括骨髓细胞遗传學(xué)检测在内的全面评估。CML 患者 TKI 疗效未达最佳反应时，应增加细胞遗传學(xué)和分(fēn)子學(xué)监测的频率。

接受 TKI 冶疗的 CML 患者出现骨髓病态造血或不能(néng)用(yòng)其他(tā)原因解释的血细胞减少等骨髓增生异常综合征（MDS）表现时，应进行骨髓细胞遗传學(xué)及其他(tā)相关检测。2.4%~10.0% 的 CML 患者接受ΤΚΓ冶疗后，可(kě)出现 Ph- 的克隆性染色體(tǐ)异常，其中伴有(yǒu)累及 7 号染色體(tǐ)异常的患者易向 MDS 进展，需提髙骨髓细胞遗传學(xué)检测的频率。

2.3 CML 的分(fēn)子學(xué)监测

分(fēn)子學(xué)监测包括采用(yòng) RQ-PCR 技术检测 BCR-ABL 转录本水平及 PCR 结合直接测序技术检测 BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变。

样本采集、送检、RNA 制备及逆转录合成 cDNA： CML 患者的骨髓和外周血均可(kě)用(yòng)于诊断及治疗过程中的分(fēn)子學(xué)监测，但建议治疗过程中一直采用(yòng)外周血监测 BCR-ABL 转录本水平。标本采集量根据白细胞计数相应调整，对于白细胞计数正常的患者，抽取不少于 8ml 的外周血标本。采用(yòng) EDTA 或枸橼酸钠抗凝标本。标本抽取后 4℃运输和存放，并于 24h 内处理(lǐ)。

通过裂解红细胞获得有(yǒu)核细胞来提取 RNA，采用(yòng)合适的裂解配方和裂解时间。RNA 提取建议采用(yòng)经典的 TRIzol 法。逆转录时建议采用(yòng) M-MLV 或 Superscript 逆转录酶，并选择随机六聚體(tǐ)引物(wù)。

确定 BCR-ABL 融合基因类型： CML 患者均具有(yǒu) BCR-ABL 融合基因，95% 以上為(wèi) P210 型 BCR-ABL，其余為(wèi) P230、P190 或变异型。患者初诊时需采用(yòng)定性或 RQ-PCR 确定 BCR-ABL 类型。治疗随访时需采用(yòng)相应反应體(tǐ)系检测 BCR-ABL 转录本水平。

RQ-PCR 检测 BCR-ABL（P210）转录本水平：建议采用(yòng)探针法进行 RQ-PCR。内参基因可(kě)以选择 ABL、BCR 或 GUS。分(fēn)子學(xué)反应定义见表 1。為(wèi)评价患者是否获得 MR4.0、MR4.5 和 MR5.0，ABL 拷贝数分(fēn)另 IJ 要髙于 10000、32000 和 100000。每批 RQ-PCR 实验中均需以质粒為(wèi)标准品制作标准曲線(xiàn)，质粒标准品拷贝数应介于 102~106。

每一批 RQ-PCR 实验均需要有(yǒu)阳性和阴性对照。阳性对照同时作為(wèi)室内批间质控样品，包括髙拷贝及低拷贝两种，二者的 BCR-ABL 转录本水平差别应在 3 个对数级左右。通过每批实验使用(yòng)相同的质控样品来监测 RQ-PCR 稳定性。每份待测样品的 BCR-ABL 及 ABL 均应做平行管检测或至少低拷贝样品重复检测。

使用(yòng) BCR-ABLIS 来反映 BCR-ABL（P210）转录本水平以正确评价患者疗效。建议实验室在检测體(tǐ)系稳定后尽早获得有(yǒu)效的转换系数（CF）以转换 BCR-ABL1S，并通过定期的评估即室间质控样品比对校正来保证 CF 持续准确。此外，CF 仅适用(yòng)于具有(yǒu) P210 型 BCR-ABL、转换后 BCR-ABL1S≤10%CML 患者的转换。

直接测序法检测 BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变：只有(yǒu)髙质量的 cDNA 样本才能(néng)保证突变检测结果的可(kě)靠性。建议选用(yòng)巢式 PCR 扩增，首先扩增 BCR-ABL，再扩增 BCR-ABL 上的 ABL。PCR 产物(wù)尽可(kě)能(néng)覆盖目前已报道的有(yǒu)临床意义的突变，建议至少能(néng)够准确检测 ABL 上第 240~490 号氨基酸密码子。

选用(yòng)髙保真的 DNA 聚合酶。建议采用(yòng)直接测序法双向测序，测序图谱应完整且背景干净。根据与参比序列比对的结果及测序图谱判定点突变结果，排除 SNP 位点及非特异性结果。

结果报告：除了患者的基本信息外，BCR-ABL 转录本水平报告的内容还应包括：

BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变的报告内容还应包括：

是否检测到突变；

突变的氨基酸位点及类型；

突变的碱基类型。

结果是否正常（阳性 / 阴性）；

BCR-ABL 和 ABL 的拷贝数；

BCR-ABL 转录本水平检测值，以（BCR-ABL 拷贝数 /ABL 拷贝数）×100% 的百分(fēn)数形式表示；

在获得有(yǒu)效 CF 后，通过 BCR-ABL 检测值×CF 得出 BCR-ABLIS，在 BCR-ABLIS≤10% 时报告，若 >10%，可(kě)以以 BCR-ABLIS>10% 形式而不以具體(tǐ)数值报告；

对于 ABL 拷贝数不合格及有(yǒu)质量问题的标本，要提示；

建议报告中包括不同治疗时间点 BCR-ABLIS 态变化曲線(xiàn)。

ΤΚI 冶疗 CML 患者分(fēn)子學(xué)监测的建议：

BCR-ABL 转录本水平检测时机：TKI 开始治疗时每 3 个月 1 次；获得 MMR 后，每 3~6 个月进行监测；当 BCR-ABL 转录本水平介于最佳反应及治疗失败之间，即“警告”时，应增加检测的频率；当 BCR-ABL 转录本水平明显增高并丧失 MMR 时，患者应尽早接受复查。

BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变检测的时机：初诊 CML-CP 患者可(kě)以不进行突变检测，AP 和 BC 患者可(kě)在 TKI 治疗前进行突变检测；CML 患者在ΤΚΓ冶疗中，未获得最佳疗效、治疗失败或出现病情进展时，应进行 BCR-ABL 激酶區(qū)突变检测，特别是在考虑选择尼洛替尼或达沙替尼作為(wèi)二線(xiàn)治疗前，以指导选择敏感的 TKI。二線(xiàn)治疗后未达到最佳疗效的患者亦应进行突变检测。

BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)点突变类型对 TKI 药物(wù)选择的指导意义：BCR-ABL 激酶區(qū)突变类型繁多(duō)，目前已超过 80 种。伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼对部分(fēn) BCR-ABL 激酶區(qū)突变类型有(yǒu)不同的敏感性。

目前已发现的突变类型中，T315I 对三种 TKI 均耐药；超过一半的突变型对伊马替尼耐药；V299L、F317L/V/I/C 和 T315A 对达沙替尼耐药；Y253F/H、E255K/V 和 F359V/I/C 对尼洛替尼耐药。对于其他(tā)突变类型，可(kě)以参考已报道的 IC50 数据及患者的其他(tā)因素选择 TKI。

3. CML 监测的展望

未来应重视在 TKI 冶疗中的规范化监测，并将这一理(lǐ)念在國(guó)内血液科(kē)医师和患者中大力普及，使之常规监测。应进一步推进中國(guó) RQ-PCR 國(guó)际标准化项目，在各地區(qū)建立技术可(kě)靠的标准实验室，以方便医师和患者进行监测，并且方便交流或共享检测结果。

期待更方便、快捷、敏感、精确的定量 PCR 和突变检测技术的日臻成熟，进一步提髙 CML 治疗中的监测效能(néng)，以指导或干预治疗。TKI 的问世使 CML 已从一个恶性血液肿瘤转成為(wèi)一种慢性可(kě)控制性疾病，未来有(yǒu)望逐渐走人社區(qū)医院。普及和推广 CML 的标准化、规范化监测，将為(wèi)这一疾病的新(xīn)型管理(lǐ)模式提供支撑和保障。